地高辛（DIG）:高靈敏度的非放射性核酸標記/檢測體系

羅氏應用科學部（Roche Applied Science）是zui早致力于向用戶提供非放射標記技術的公司之一，讓更多的科研工作者們可以避免使用危險的放射性同位素。自1995年羅氏的地高辛產品上市以來，盡管陸續有許多出色的競爭者涉足這一領域，盡管有定量PCR技術的應用，DIG系統仍然是非放射性標記—檢測技術的，被廣泛地應用各種膜雜交及原位雜交技術中。 

      
   技術原理：

      地高辛標記技術源于一種從洋地黃類植物（毛地黃和毛花毛地黃）中提取的類固醇（Steroid）物質—— Digoxigenin  （DIG），在醫學上可用于治療各種急性和慢性心功能不全以及室上性心動過速、心房顫動和撲動等疾病。由于洋地黃植物的花和葉片Digoxigenin在自然界中的*來源，因此抗DIG的抗體不會與其他的生物物質結合，從而可以滿足特異性標記的需要。這一點，正是DIG勝于生物素（Biotin）的地方——同樣是小分子標記物，生物素廣泛存在于各種組織中，對于靈敏度很高的標記檢測實驗來說，樣品自身含有的內源生物素，就會對結果產生干擾。地高辛就能夠很好地避免這個問題。

      與放射性標記和檢測技術相比較，DIG 系統具有一下多個優勢：
            è    高靈敏度，*可滿足實驗需要，某些方面甚至可與放射性標記的靈敏度向媲美
            è    曝光時間短，結果顯示時間以分鐘計算，無需幾小時甚至幾天的自顯影過程
            è    安全環保，不接觸放射性物質，不會對環境造成污染
            è    探針可重復使用，zui少可以穩定儲存一年
            è    可輕松進行探針撥離和重探
            è    憑借多年的經驗和眾多使用者的反饋意見，提供全面的應用指南

             
   應用領域：
      地高辛系統能夠安全地標記DNA, RNA或是寡聚核苷酸探針，這些探針可以被廣泛地應用在
            è     Southern blotting, dot blotting
            è     Northern blotting
            è     Array
            è     Colony hybridization
            è     In situ hybridization
            è     ELISA
             
   技術細節：
      DIG 通過一個含有11個碳原子的空間臂與尿嘧啶核苷酸上的C5位置相連，一定濃度的DIG標記的核苷酸可以通過DNA 
       polymerase （如E.coli DNA Polymerase, T4 DNA Polymerase, T7 DNA 
       Polymerase, Reverse Transcriptase, Taq DNA Polymerase ）、RNA 
       polymerase （如SP6, T3或T7 RNA Polymerase）或是末端轉移酶（Terminal 
       Transferase）的作用摻入到核苷酸探針中；也可通過隨即引物標記（random primed labeling）, 
       缺口平移（nick   translation），PCR，3’端標記/加尾或是體外轉錄制備帶有DIG標記的探針。當然也可以通過化學合成的方法進行核苷酸的標記。
               
            Fig. Structure of Alkali-liable Digoxigenin（DIG）-dUTP
             
      對于DIG 標記探針的雜交檢測，可選用連接有堿性磷酸酶（alkaline            phosphatase），過氧化物酶（peroxidase）,熒光素（fluorescein）,若丹明（rhodamine）或是膠體金（colloidal  gold）高親和性的抗DIG抗體共軛物；也可選用不帶任何共軛連接的抗DIG抗體和二級抗體。
             
      檢測的靈敏度主要依賴于對不同抗DIG抗體共軛物顯示方法的選擇。以連接有堿性磷酸酶的抗DIG 抗體為例：即可以使用NBT或BCIP做底物的顯色法，也可以使用HNPP熒光堿性磷酸酶底物，檢測的靈敏度常規可達到0.1pg   （Souther blot）。