BACPAC——FISH克隆基因DNA產(chǎn)物

BACPAC

鏈接：https://bacpacresources.org/

BACPAC基因組學(xué)是由初在紐約州布法羅市Roswell Park癌癥研究所（2000年以前）和美國(guó)加利福尼亞州奧克蘭市CHORI的學(xué)術(shù)實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)建BAC（和PAC）庫(kù)的科學(xué)家們于2000年至2020年間創(chuàng)建的。包含了由BAC、PAC或Fosmid克隆組成的可用基因組DNA文庫(kù)、一些cDNA文庫(kù)、文庫(kù)篩選試劑（高密度克隆雜交過(guò)濾器）以及BAC、PAC和Fosmid克隆載體的信息。自2019年9月1日起，BACPAC資源不再在奧克蘭兒童醫(yī)院研究所運(yùn)營(yíng)，所有訂單均由一家小型公司“BACPAC Genomics"處理，該公司初位于加利福尼亞州Richmond。

通過(guò)BAC修飾（BAC modification/recombineering），我們可以將報(bào)告基因放置在BAC特定的調(diào)控序列之后，也可以將點(diǎn)突變引入目的基因、或是將BAC上的片段轉(zhuǎn)移到質(zhì)粒載體上以及在BAC骨架上添加篩選標(biāo)記等。

服務(wù)說(shuō)明

為您購(gòu)買(mǎi)BAC

如果您知道您需要的BAC的ID號(hào)，請(qǐng)?zhí)峁┙o我們，我們將為您購(gòu)買(mǎi)。如果對(duì)使用的BAC有疑惑，我們也可以根據(jù)您研究的基因?yàn)槟业胶线m的BAC。絕大多數(shù)BAC可從CHORI 的BACPAC資源中心獲取，但某些BAC需要從其他供應(yīng)商購(gòu)買(mǎi)。您也可以直接給我們寄送含有BAC的大腸桿菌。

“一步法BAC修飾"

既可用于引入大片段如在某個(gè)基因的啟動(dòng)子后面加上用于示蹤的報(bào)告基因（圖1），也可引入小改變，如點(diǎn)突變（圖2）。

大片段的引入（圖1）：片段包含有目的基因（GOI）（例如LacZ或GFP報(bào)告基因）、兩側(cè)為FRT位點(diǎn)的藥物篩選表達(dá)框，其兩端具有與重組區(qū)域同源的同源臂。通過(guò)同源重組來(lái)替代BAC上的內(nèi)源區(qū)域，藥物篩選表達(dá)盒可用于鑒定成功修飾的BAC克隆，可通過(guò)Flp介導(dǎo)的重組刪除該表達(dá)盒，只留下一個(gè)FRT位點(diǎn)。

圖1. “一步法BAC修飾"示意圖：在啟動(dòng)子后面引入目的基因（GOI）(如LacZ或GFP報(bào)告基因)

引入點(diǎn)突變（圖2）：片段包含突變區(qū)域、兩側(cè)為FRT位點(diǎn)的藥物篩選表達(dá)框，其兩端具有與重組區(qū)域同源的同源臂。通過(guò)同源重組取代BAC上的內(nèi)源區(qū)域，最后通過(guò)Flp介導(dǎo)的重組刪除該表達(dá)盒，只留下一個(gè)FRT位點(diǎn)。FRT位點(diǎn)被認(rèn)為是“瘢痕"序列，因?yàn)樾揎椇蟮腂AC除了所需的點(diǎn)突變之外，還攜帶這個(gè)殘留的FRT。為了不影響基因功能，該瘢痕序列要放置在基因的非功能區(qū)域，如內(nèi)含子或UTR區(qū)。

圖2. “一步法BAC修飾"示意圖：在基因的第一外顯子中引入點(diǎn)突變并將FRT序列放置在下游內(nèi)含子中

“兩步法BAC修飾"

“兩步法BAC修飾"用于將微小的變化（如點(diǎn)突變）引入BAC，而不留下FRT瘢痕序列（圖3）。該方法適用于以下情況，即在預(yù)期突變位點(diǎn)的附近，沒(méi)有合適的空間放置殘留的FRT瘢痕序列。例如，如果要修飾的基因是非常大的單外顯子基因，并且所需的突變位點(diǎn)位于基因的中間，則在點(diǎn)突變附近沒(méi)有合適的位置來(lái)放置瘢痕序列。在這種情況下，應(yīng)該使用兩步法，該方法利用表達(dá)藥物篩選標(biāo)記的基因片段進(jìn)行陽(yáng)性和陰性篩選（圖3）。第一步，使用該基因片段進(jìn)行同源重組來(lái)替代內(nèi)源靶區(qū)域，通過(guò)藥物陽(yáng)性篩選獲得成功重組的BAC；第二步，通過(guò)同源重組，使用包含突變位點(diǎn)的片段替代藥物篩選基因片段，利用陰性選擇篩出實(shí)現(xiàn)點(diǎn)突變的BAC。

圖3. “兩步法BAC修飾"示意圖：在大的單個(gè)外顯子基因中引入點(diǎn)突變而不留下瘢痕序列

將篩選標(biāo)記添加到BAC骨架上

使用該類(lèi)BAC轉(zhuǎn)染到細(xì)胞時(shí)，BAC骨架上的篩選標(biāo)記將有利于其在細(xì)胞中被篩選或示蹤，這將有利于通過(guò)藥物篩選分離含有穩(wěn)定整合BAC的細(xì)胞。

將BAC上的片段轉(zhuǎn)移到質(zhì)粒載體上

我們可以將BAC的任何區(qū)域（可達(dá)60 kb）轉(zhuǎn)移到質(zhì)粒載體上單獨(dú)進(jìn)行研究。例如，如果利用整個(gè)BAC構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠以研究在BAC上某個(gè)基因的功能，同一BAC上的其他基因可能會(huì)對(duì)研究結(jié)果有影響，而將目的基因單獨(dú)分離到質(zhì)粒上并使用該質(zhì)粒構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠可以避免這個(gè)問(wèn)題。另外，在技術(shù)層面，使用質(zhì)粒比使用BAC更加簡(jiǎn)單。

BAC修飾的鑒定

BAC修飾區(qū)域?qū)⑼ㄟ^(guò)測(cè)序鑒定。由于重復(fù)序列的存在，BAC可能會(huì)發(fā)生片段缺失。為了降低這種可能性，我們將重新轉(zhuǎn)化修飾后的BAC，并挑選獲得單克隆，通過(guò)在整個(gè)BAC上進(jìn)行多個(gè)位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增來(lái)確認(rèn)其沒(méi)有發(fā)生大片段缺失。

BACPAC常賣(mài)產(chǎn)品