單克隆抗體的基本原理和過程

 

     通過細胞融合技術將B淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，所產生的融合細胞既具有親本骨髓瘤細胞的無限繁殖的生物學特性，又具有另一親本B淋巴細胞合成、分泌特異性抗體的能力。應用此技術從一個抗體分泌性B細胞雜交瘤分裂增殖，形成一個大的細胞克隆。由B細胞雜交瘤細胞克隆產生的只識別抗原分子上某一個抗原決定簇的純抗體，即單克隆抗體。單克隆抗體具有純度高、特異性強、利于實驗標準化即可大量生產供應等特點。

    在單克隆抗體制備中，雖然除小鼠外其它動物也可用于制備雜交瘤，但本書以小鼠為例來說明有關技術，同樣的技術也可用于大鼠骨髓瘤的融合及抗體篩選。對特殊動物之間或與人細胞的融合，也有簡要說明。

單克隆抗體的制備是一個復雜、精細的工藝過程。為對全過程有一個概括的了解，先用表1 列出mAbs制備過程中的各個階段。一般將全過程分為三個階段：（1）免疫小鼠；（2）建立篩選方法和程序；及（3）雜交瘤生成。 

  *得到擴增的陽性雜交瘤細胞后，可從其培養液中收集含單克隆抗體的上清液，進行鑒定（其抗體含量為10-50µg/ml）；

  *雜交瘤細胞也可進行小鼠腹腔注射，以產生Mab含量高的腹水（其抗體含量為1-10mg/ml）。            

     以上每一階段都有可能迅速順利完成，但各階段也都有其本身的問題，需在實驗開始前予以充分考慮，以免影響全局。以下分別進行討論。動物在注入抗原后，一旦出現良好的體液免疫應答，同時又已建立合用的篩選方法，并通過血清對所建立篩選方法進行評價、確定方法后，才可開始雜交瘤細胞的制備。其過程大致為：在細胞融合前數日，用抗原免疫動物；將從免疫動物得到的分泌抗體的細胞與骨髓瘤細胞相混，進行細胞融合（有效的細胞融合約可得1/10⁵存活的雜交細胞）；其后，將融合細胞用所選擇的培養基限定稀釋，置多孔培養板進行培養。在細胞融合后一周，即可對雜交瘤進行測試，從陽性培養孔所取的細胞先增殖，然后，進行克隆化（即單克隆生長），雜交瘤的生成與克隆需要時間，很少的實例只需要兩個月，有的甚至要一年時間。因制備mAbs 過程中的每一步都對其后各步影響很大，因此均需注意選擇zui適宜的條件，如：

l         要注意抗原的選擇及其性質，如細胞、蛋白質、半抗原等；

l         根據抗原得性質和得量和對抗體得要求等，計劃及建立免疫的途徑和方式；

l         選定篩選的方法：抗體篩選的測試方法必須簡單、可重復、特異，并可適用于mAb的zui終使用（即免疫熒光、免疫沉淀、功能試驗等中的應用）；

l         要確定細胞培養的條件；

l         進行細胞融合的方式：包括雜交方法和細胞的選擇，和克隆的方式（限制性稀釋或軟膠法）等。

   典型的單克隆抗體的制備過程為：

1． *次對每一小鼠注射500µl抗原與*福氏佐劑1：1的混和液（ip）。 共注6支BALB/c雌性小鼠（抗體的實際需用量見表2）；

2．14天后，再次注射，但改用抗原與不*福氏佐劑混合液；

3．第24天，從免疫小鼠尾靜脈取血，血清經PBS 1：5稀釋，以同樣稀釋的正常血清為對照，用點雜交（Dot blot）法進行測定；

4．第35天，所有小鼠均經腹腔再注射抗原與不*福氏佐劑混合液；

5．第45天，取尾靜脈血，用點雜交法再次檢測。所有血清樣品均通過與在體同位素標記的抗原進行免疫沉淀法檢測；

6．第56天，對免疫應答的小鼠再靜脈注射100µl 及腹腔注視100µl不*福氏佐劑抗原混合液，而對所有其余小鼠僅腹腔注射不*福氏佐劑抗原混合液；

7．第59天由免疫應答的小鼠取脾細胞進行細胞融合；

8．第66天，開始艱巨的工作，尋找*個陽性克隆的篩選。

*具體免疫抗原用量參見表2。 

ip 腹腔注射； sc 皮下注射；iv 靜脈注射 

   雜交瘤得制備需要優良的組織培養設備及訓練有素、有經驗的專門技術人員。

   培養雜交瘤及有關細胞所需設備有：

l         有專門空氣過濾裝置的細胞培養場所

l         有關實驗動物所需條件

l         免疫用注視器和針頭

l         通風櫥

l         濕度維持5-8%、37℃的CO₂ 孵箱

l         倒置顯微鏡（具有×10及 ×20物鏡，× 10-15 目鏡）

l         用于細胞記數的光學顯微鏡

l         紅細胞記數器

l         37℃水浴

l         洗細胞用低溫離心機

l         一次性塑料培養板（24孔和96孔）及培養瓶

l         15及50ml 消毒的聚丙烯錐形管

l         消毒1，2，5及10 ml 的吸管及吸液器

l         低溫冰箱（–80℃）及液氮罐  

1．Galfre, G. And Milstein, C. （1981） Preparation of monoclonal antibodies: strategies and procedure. Methods in Enzymology. 73,3-46

2．瘤技術與單克隆抗體制備”  見巴德年主編 《當代免疫學技術與應用》pp.351-373 北京醫科大學中國協和醫科大學出版社 1998。

3．胞融合雜交及單克隆抗體技術”  見楊景山主編《醫學細胞化學與細胞生物學技》pp.452-469北京醫科大學中國協和醫科大學聯合出版社  1992 。