單克隆抗體的基本原理和過程

 

     通過細(xì)胞融合技術(shù)將B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，所產(chǎn)生的融合細(xì)胞既具有親本骨髓瘤細(xì)胞的無限繁殖的生物學(xué)特性，又具有另一親本B淋巴細(xì)胞合成、分泌特異性抗體的能力。應(yīng)用此技術(shù)從一個(gè)抗體分泌性B細(xì)胞雜交瘤分裂增殖，形成一個(gè)大的細(xì)胞克隆。由B細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞克隆產(chǎn)生的只識(shí)別抗原分子上某一個(gè)抗原決定簇的純抗體，即單克隆抗體。單克隆抗體具有純度高、特異性強(qiáng)、利于實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化即可大量生產(chǎn)供應(yīng)等特點(diǎn)。

    在單克隆抗體制備中，雖然除小鼠外其它動(dòng)物也可用于制備雜交瘤，但本書以小鼠為例來說明有關(guān)技術(shù)，同樣的技術(shù)也可用于大鼠骨髓瘤的融合及抗體篩選。對(duì)特殊動(dòng)物之間或與人細(xì)胞的融合，也有簡(jiǎn)要說明。

單克隆抗體的制備是一個(gè)復(fù)雜、精細(xì)的工藝過程。為對(duì)全過程有一個(gè)概括的了解，先用表1 列出mAbs制備過程中的各個(gè)階段。一般將全過程分為三個(gè)階段：（1）免疫小鼠；（2）建立篩選方法和程序；及（3）雜交瘤生成。 

  *得到擴(kuò)增的陽性雜交瘤細(xì)胞后，可從其培養(yǎng)液中收集含單克隆抗體的上清液，進(jìn)行鑒定（其抗體含量為10-50µg/ml）；

  *雜交瘤細(xì)胞也可進(jìn)行小鼠腹腔注射，以產(chǎn)生Mab含量高的腹水（其抗體含量為1-10mg/ml）。            

     以上每一階段都有可能迅速順利完成，但各階段也都有其本身的問題，需在實(shí)驗(yàn)開始前予以充分考慮，以免影響全局。以下分別進(jìn)行討論。動(dòng)物在注入抗原后，一旦出現(xiàn)良好的體液免疫應(yīng)答，同時(shí)又已建立合用的篩選方法，并通過血清對(duì)所建立篩選方法進(jìn)行評(píng)價(jià)、確定方法后，才可開始雜交瘤細(xì)胞的制備。其過程大致為：在細(xì)胞融合前數(shù)日，用抗原免疫動(dòng)物；將從免疫動(dòng)物得到的分泌抗體的細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞相混，進(jìn)行細(xì)胞融合（有效的細(xì)胞融合約可得1/10⁵存活的雜交細(xì)胞）；其后，將融合細(xì)胞用所選擇的培養(yǎng)基限定稀釋，置多孔培養(yǎng)板進(jìn)行培養(yǎng)。在細(xì)胞融合后一周，即可對(duì)雜交瘤進(jìn)行測(cè)試，從陽性培養(yǎng)孔所取的細(xì)胞先增殖，然后，進(jìn)行克隆化（即單克隆生長(zhǎng)），雜交瘤的生成與克隆需要時(shí)間，很少的實(shí)例只需要兩個(gè)月，有的甚至要一年時(shí)間。因制備mAbs 過程中的每一步都對(duì)其后各步影響很大，因此均需注意選擇zui適宜的條件，如：

l         要注意抗原的選擇及其性質(zhì)，如細(xì)胞、蛋白質(zhì)、半抗原等；

l         根據(jù)抗原得性質(zhì)和得量和對(duì)抗體得要求等，計(jì)劃及建立免疫的途徑和方式；

l         選定篩選的方法：抗體篩選的測(cè)試方法必須簡(jiǎn)單、可重復(fù)、特異，并可適用于mAb的zui終使用（即免疫熒光、免疫沉淀、功能試驗(yàn)等中的應(yīng)用）；

l         要確定細(xì)胞培養(yǎng)的條件；

l         進(jìn)行細(xì)胞融合的方式：包括雜交方法和細(xì)胞的選擇，和克隆的方式（限制性稀釋或軟膠法）等。

   典型的單克隆抗體的制備過程為：

1． *次對(duì)每一小鼠注射500µl抗原與*福氏佐劑1：1的混和液（ip）。 共注6支BALB/c雌性小鼠（抗體的實(shí)際需用量見表2）；

2．14天后，再次注射，但改用抗原與不*福氏佐劑混合液；

3．第24天，從免疫小鼠尾靜脈取血，血清經(jīng)PBS 1：5稀釋，以同樣稀釋的正常血清為對(duì)照，用點(diǎn)雜交（Dot blot）法進(jìn)行測(cè)定；

4．第35天，所有小鼠均經(jīng)腹腔再注射抗原與不*福氏佐劑混合液；

5．第45天，取尾靜脈血，用點(diǎn)雜交法再次檢測(cè)。所有血清樣品均通過與在體同位素標(biāo)記的抗原進(jìn)行免疫沉淀法檢測(cè)；

6．第56天，對(duì)免疫應(yīng)答的小鼠再靜脈注射100µl 及腹腔注視100µl不*福氏佐劑抗原混合液，而對(duì)所有其余小鼠僅腹腔注射不*福氏佐劑抗原混合液；

7．第59天由免疫應(yīng)答的小鼠取脾細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合；

8．第66天，開始艱巨的工作，尋找*個(gè)陽性克隆的篩選。

*具體免疫抗原用量參見表2。 

ip 腹腔注射； sc 皮下注射；iv 靜脈注射 

   雜交瘤得制備需要優(yōu)良的組織培養(yǎng)設(shè)備及訓(xùn)練有素、有經(jīng)驗(yàn)的專門技術(shù)人員。

   培養(yǎng)雜交瘤及有關(guān)細(xì)胞所需設(shè)備有：

l         有專門空氣過濾裝置的細(xì)胞培養(yǎng)場(chǎng)所

l         有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所需條件

l         免疫用注視器和針頭

l         通風(fēng)櫥

l         濕度維持5-8%、37℃的CO₂ 孵箱

l         倒置顯微鏡（具有×10及 ×20物鏡，× 10-15 目鏡）

l         用于細(xì)胞記數(shù)的光學(xué)顯微鏡

l         紅細(xì)胞記數(shù)器

l         37℃水浴

l         洗細(xì)胞用低溫離心機(jī)

l         一次性塑料培養(yǎng)板（24孔和96孔）及培養(yǎng)瓶

l         15及50ml 消毒的聚丙烯錐形管

l         消毒1，2，5及10 ml 的吸管及吸液器

l         低溫冰箱（–80℃）及液氮罐  

1．Galfre, G. And Milstein, C. （1981） Preparation of monoclonal antibodies: strategies and procedure. Methods in Enzymology. 73,3-46

2．瘤技術(shù)與單克隆抗體制備”  見巴德年主編 《當(dāng)代免疫學(xué)技術(shù)與應(yīng)用》pp.351-373 北京醫(yī)科大學(xué)中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社 1998。

3．胞融合雜交及單克隆抗體技術(shù)”  見楊景山主編《醫(yī)學(xué)細(xì)胞化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)技》pp.452-469北京醫(yī)科大學(xué)中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社  1992 。