ProMap® 初始 CFSE T 細(xì)胞增殖檢測(cè)說(shuō)明書(shū)
繪制幼稚 T 細(xì)胞反應(yīng)的金標(biāo)準(zhǔn)
ProImmune 的 ProMap® T 細(xì)胞增殖測(cè)定可用于鑒定引發(fā)輔助 T 細(xì)胞增殖并因此可能引起輔助 T 細(xì)胞免疫反應(yīng)的表位序列。
與基于放射性胸苷摻入的傳統(tǒng)測(cè)定不同，該測(cè)定利用強(qiáng)大的流式細(xì)胞術(shù)方法，能夠準(zhǔn)確測(cè)定增殖細(xì)胞的百分比和 T 細(xì)胞反應(yīng)的詳細(xì)表型，所有這些都顯著提高了整體靈敏度。
為什么選擇 ProMap® CFSE 增殖檢測(cè)？CFSE 染料稀釋是一種久經(jīng)考驗(yàn)的方法，已在數(shù)千份出版物中引用 比放射性檢測(cè)靈敏得多 流式細(xì)胞儀讀數(shù)可解析要分析的正確細(xì)胞群，例如活 CD4+ T 細(xì)胞 進(jìn)一步的子集表型易于添加，并且可以同時(shí)讀出子集的增殖 整體分析測(cè)量增殖時(shí)間范圍內(nèi)的所有增殖，而不是在孵育時(shí)間結(jié)束時(shí)的時(shí)間窗口內(nèi) |
主要出版物：
使用英國(guó)國(guó)防部 (MoD) 的一部分 [dstl] 發(fā)布的 ProMap® T 細(xì)胞分析驗(yàn)證抗體人源化
圖 1比較了抗體的小鼠和人源化 V 區(qū)中重疊肽 T 細(xì)胞的反應(yīng)。
O'Brien LM、Goodchild SA、Phillpotts RJ、Perkins SD。
病毒學(xué) (2012) 426(2):100-5。[PMID:22341308]
英國(guó)政府國(guó)防科學(xué)與技術(shù)實(shí)驗(yàn)室 [dstl] 的科學(xué)家使用 ProImmune 的 T 細(xì)胞增殖試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證他們的抗委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒 (VEEV) 抗體的人源化。序列人源化是將抗體中的動(dòng)物蛋白序列替換為人源蛋白序列的合理設(shè)計(jì)方法。然而，這種方法并不能保證得到的生物制品具有低免疫原性。通過(guò)使用序列掃描 體外 T 細(xì)胞測(cè)定，可以生成抗原性數(shù)據(jù)以顯示嵌合序列和人源化序列之間的差異。 在此處閱讀完整的案例研究。
ProMap® T 細(xì)胞檢測(cè)和肽/蛋白質(zhì)療法
ProMap® T 細(xì)胞增殖測(cè)定已開(kāi)發(fā)用于識(shí)別潛在 T 細(xì)胞表位的存在或不存在，可用于新肽或蛋白質(zhì)的臨床前發(fā)現(xiàn)。這些分析可以解決結(jié)構(gòu)相似分子之間的“相對(duì)免疫原性"問(wèn)題；例如，它們可以幫助區(qū)分不同的候選者，或者可以表明蛋白質(zhì)工程策略在潛在免疫治療的去免疫中的成功。
作為 ProImmune 的 REVEAL® 免疫原性系統(tǒng)的一部分， ProMap® T 細(xì)胞增殖試驗(yàn)的結(jié)果可以與 50 多個(gè) II 類 HLA 等位基因的無(wú)細(xì)胞 HLA 肽結(jié)合試驗(yàn)的結(jié)果一起分析。這為客戶提供了對(duì)一種或多種藥物先導(dǎo)的輔助 T 細(xì)胞免疫反應(yīng)的詳細(xì)資料。
| 圖 2： ProMap® T 細(xì)胞增殖檢測(cè)原理。 用于 20-50 個(gè) HLA 型供體的 PBMC 選自 ProImmune 生物庫(kù) 根據(jù)項(xiàng)目要求合成肽庫(kù) 供體 PBMC 用 CFSE 染料標(biāo)記。 每個(gè)肽與來(lái)自每個(gè)供體的 PBMC 共培養(yǎng)。 CD4+ T 細(xì)胞響應(yīng)肽的增殖導(dǎo)致 CFSE 標(biāo)記的稀釋。 CFSE 的流式細(xì)胞術(shù)分析與 CD4 染色相結(jié)合，用于定量細(xì)胞分裂，并提供抗原性的測(cè)量。
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在我們的 Mastering Immunity 2020 會(huì)議的這段短片中，Tim Hickling 博士（羅氏免疫安全負(fù)責(zé)人）描述了如何將 ProMap ® T 細(xì)胞增殖檢測(cè)應(yīng)用于生物治療藥物的去免疫。
ProMap® T 細(xì)胞增殖檢測(cè)詳細(xì)信息
細(xì)胞用熒光染料 5,6-羧基熒光素二乙酸琥珀酰亞胺酯 (CFSE) 進(jìn)行標(biāo)記。那些響應(yīng)抗原而增殖的細(xì)胞顯示出 CFSE 熒光強(qiáng)度的降低，這可以通過(guò)流式細(xì)胞儀直接測(cè)量。由于這是一種流式細(xì)胞儀檢測(cè)，它可以準(zhǔn)確地確定增殖 CD4+ 細(xì)胞的百分比，能夠?qū)?T 細(xì)胞反應(yīng)進(jìn)行詳細(xì)的表型分析，并且比基于放射性胸苷摻入的傳統(tǒng)檢測(cè)更敏感。
ProImmune 提供兩種類型的 T 細(xì)胞增殖檢測(cè)：
用于肽表位作圖的 ProMap® T 細(xì)胞檢測(cè)
該測(cè)定法用于鑒定可引發(fā)輔助 CD4+ T 細(xì)胞增殖并因此可能導(dǎo)致輔助 T 細(xì)胞免疫反應(yīng)的肽表位序列，該反應(yīng)可能導(dǎo)致抗藥物抗體 (ADA) 反應(yīng)或其他不需要的免疫原性。該測(cè)定還可用于評(píng)估蛋白質(zhì)序列的有益免疫原性，例如用于免疫療法的表位發(fā)現(xiàn)。
在該測(cè)定旨在關(guān)注 CD4+ 輔助 T 細(xì)胞反應(yīng)的情況下，CD8+ T 細(xì)胞耗盡和 CFSE 標(biāo)記的供體 PBMC 與 5uM 每種感興趣的肽一起在六個(gè)重復(fù)孔中培養(yǎng) 7 天。每個(gè)測(cè)定板包括一組未經(jīng)處理的對(duì)照孔。該測(cè)定還結(jié)合了參考抗原對(duì)照，包括已知 MHC II 類抗原的合成肽和兩種有效的全蛋白抗原。
圖 3： 來(lái)自初始 T 細(xì)胞試驗(yàn)的染色數(shù)據(jù)示例，(1) CFSE 標(biāo)記的 T 細(xì)胞在培養(yǎng)基中單獨(dú)培養(yǎng)（未刺激），(2) CFSE 標(biāo)記的 T 細(xì)胞與目標(biāo)抗原衍生的肽一起培養(yǎng)，(3) CFSE-用對(duì)照蛋白 (Tuberculin PPD) 培養(yǎng)的標(biāo)記 T 細(xì)胞。
通過(guò)流式細(xì)胞儀分析確定細(xì)胞增殖。對(duì)于 ProMap® T 細(xì)胞測(cè)定，通過(guò)與未刺激樣品的結(jié)果進(jìn)行比較，確定每個(gè)受刺激樣品的高于背景的刺激百分比。每個(gè)樣本中 CD4+ CFSE 暗淡種群的計(jì)數(shù)表示為總 CD4+ 種群的比例。六個(gè)重復(fù)值用于計(jì)算高于背景的刺激百分比（有抗原刺激的 CD4+ CFSE 暗細(xì)胞的比例，減去沒(méi)有抗原刺激的 CD4+ CFSE 暗細(xì)胞的比例）。
從一式六份的值計(jì)算平均值和平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。如果高于背景的百分比刺激大于 0.5% 并且也大于高于背景的 2 倍標(biāo)準(zhǔn)誤差，則結(jié)果被認(rèn)為是“陽(yáng)性"，盡管數(shù)據(jù)也顯示了不太嚴(yán)格的閾值，以允許考慮小響應(yīng)。
為了允許比較肽， 計(jì)算響應(yīng)指數(shù) 。該指數(shù)基于將每種肽的反應(yīng)幅度（高于背景的刺激百分比）乘以每種肽的反應(yīng)供體數(shù)量（抗原性百分比）。
報(bào)告中提供的數(shù)據(jù)是：
圖 4： 使用 ProMap® T 細(xì)胞增殖測(cè)定法測(cè)量的抗原性百分比：一組 43 名供體用于測(cè)試來(lái)自兩種治療性單克隆抗體 Remicade 和 Humira 重鏈區(qū)的肽的潛在免疫原性。每個(gè)供體用不同的顏色表示。引起 2 個(gè)或更多供體反應(yīng)的肽被認(rèn)為值得進(jìn)一步研究。
圖 5： ProMap® T 細(xì)胞增殖試驗(yàn)的反應(yīng)指數(shù)：來(lái)自與圖 3 相同試驗(yàn)的數(shù)據(jù)——反應(yīng)指數(shù)指示了對(duì)測(cè)試肽反應(yīng)的幅度和數(shù)量。請(qǐng)注意，PPD 的響應(yīng)超出了該圖的范圍。
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