fivephoton hBACE1-ELISA

fivephoton hBACE1-ELISA

人 BACE1試劑盒

部件編號hBACE1-ELISA

ELISA 

僅用于研究。不適用于診斷應用。

儲存：4oC，到達后 6 個月

安全性：終止液含有酸。避免眼睛和皮膚接觸標準肽濃度：225 pg/mL

分析范圍：5-200 pg/mL 靈敏度：2.5 pg/mL

實驗原理

試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗 (ELISA) 測定 BACE1 濃度。將樣品應用于預先包被親和純化的多克隆抗 BACE1 抗體的微量 elisa 微孔中。孵育樣品，然后清洗。加入第二種山羊抗 BACE1-HRP 結(jié)合物抗體，然后孵育并清洗。加入顯色液 A 和 B，導致顏色變?yōu)樗{色。應用終止液終止反應，使溶液變?yōu)辄S色。采用與標準肽濃度對應的 450 nm 處的吸光度讀數(shù)測定樣品中 BACE1 的濃度。

由于 BACE1 是在分泌途徑（包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和質(zhì)膜 1）中加工的跨膜蛋白，其從細胞中提取和 ELISA 試驗中檢測的主要方法涉及使用非變性去污劑緩沖液通過細胞裂解和溶解進行制備。還在生物體液（如 CSF 2）中檢測到 BACE1：根據(jù)您計劃測定的組分，按照以下所述制備樣本。請注意，說明 7 與膜包埋部分相關(guān)。

參考文獻：

1、顏氏等。等人《生物化學雜志》2001 年 9 月 28 日；276 (39) :36788-96。電子版 2001 年 7 月 20 日。

2. Zetterberg H 等。Arch Neurol.2008 Aug;65 (8) :1102-7.

樣品制備：以下作為樣品制備的通用指南。研究應進行部門內(nèi)文獻分析，以確定制備樣品的宜方法。

1. 血清：室溫下凝固 10-20 min。以 2000-3000 rpm 離心 20 min。

收集上清液進行測定。如果出現(xiàn)沉淀，再次離心。測定上清液部分。

2. 血漿：使用適當?shù)?EDTA 或肝素作為抗凝劑。使用攪拌棒混合 10-20 min。以 2000-3000 rpm 離心 20 min。收集上清液。如果出現(xiàn)沉淀，再次離心。

3. 尿液：收集于無菌容器中。以 2000-3000 rpm 離心 20 min。收集上清，如出現(xiàn)沉淀，再次離心。收集上清液進行測定。

4. 細胞培養(yǎng)上清液：分泌成分檢測：培養(yǎng)液以 2000-3000 rpm 離心 20 min。收集上清液進行測定。

• 細胞漿：用 PBS (pH7.2-7.4) 將細胞懸液稀釋至細胞濃度為 100 萬個/ml。進行反復凍融循環(huán)，使細胞膜斷裂并釋放細胞內(nèi)成分。以 2000-3000 rpm 離心 20 min。收集上清液進行測定。如果出現(xiàn)沉淀，再次離心并測定

上清液。

• 組織（細胞質(zhì)成分）：切割組織切片并稱重。在 PBS (pH7.2-7.4) 中加入切片。用液氮快速冷凍。將樣品解凍至 2-8 ℃，加入 PBS 并均質(zhì)化。以 2000-3000 rpm 離心 20 min。除去上清液。

7. 細胞和組織勻漿和裂解物：使用非變性去污劑蛋白提取試劑（例如，F(xiàn)IVEphoton Biochemicals 部件號ELSP-1）在冰上存在蛋白酶抑制劑的情況下勻漿組織/和裂解細胞。離心細胞碎片，并使用上清液進行 ELISA 試驗。

8. 樣本可在-80 ℃ 下儲存。避免反復凍融循環(huán)。您可以將樣本等分用于隨后的 ELISA 測定。

9. 避免含有 SDS 的變性細胞裂解緩沖液如 RIPA 緩沖液。

表 1. 試劑盒包含的材料。在 4 ℃ 下儲存所有材料

需要但未提供的材料

1. 37oC 培養(yǎng)箱

2. 標準吸光度酶標儀

3. 精密移液器和一次性移液器槍頭

4. 去離子水

5. 一次性樣本稀釋管

6. 吸水紙

7. 轉(zhuǎn)移至 ELISA 皿前，用于制備溶液的 96 孔板

8. 96 通道移液管

試驗的重要注意事項和準備

1. 實驗者應進行初步試驗，以確定符合試驗范圍的樣品稀釋液。使用本試劑盒測定范圍內(nèi)的低和高濃度的標準肽，對您的樣本進行初步測定。用“樣品稀釋劑（表 1，組分 6）”混懸并稀釋實驗樣品，以符合測定范圍（或者，用含有蛋白質(zhì)阻斷劑（例如 0.25% 酪蛋白）的 PBS 稀釋樣品）。可能需要對多個樣本進行系列稀釋，以確定符合測定范圍的正確樣本濃度。如果需要調(diào)整，濃縮或稀釋實驗樣品。留出足夠的實驗樣品留樣，用于重復試驗。

2. 通過僅進行溶劑對照，確定溶劑緩沖液是否無意中與試驗發(fā)生交叉反應并產(chǎn)生顏色變化。此外，通過在溶劑中稀釋提供的標準肽，確定溶劑緩沖液中的成分是否抑制測定反應，并進行測定試驗。將結(jié)果與樣品稀釋劑中的相同標準肽稀釋液進行比較（表 1，組分 6）。為了補救，在

“樣品稀釋劑”（表 1，組分 6）或在另一種溶劑（如 PBS）中制備樣品，以防止意外的實驗讀數(shù)或試驗失活。

• 進行測定前，應將試劑盒平衡至室溫 30 min。將打開的 microelisa 板保存在密封的塑料袋中，4 ℃ 保存。推薦使用多通道移液器同時點樣。試驗期間應密封平板。不應使微孔干燥。

4. 在單獨的試管或 96 孔板中制備標準品和樣品，而不是在 ELISA 板孔中。將標準品和樣品同時轉(zhuǎn)移至 ELISA 板中。

5. 建議對樣本進行一式兩份分析，以解決移液錯誤。

6. 使用新的加樣槍頭和 ELISA 板密封劑，以避免交叉污染。

7. 請勿混合其他 ELISA 試劑盒中的試劑。

8. 避免 ELISA 板底部和側(cè)面出現(xiàn)指紋、污跡、劃痕、氣泡或液滴。

9. 請注意，未被沖洗掉的樣本中的疊氮化納可能會抑制產(chǎn)生測定顏色反應的辣根過氧化物酶 (HRP)。

10. 當根據(jù)含量測定計算樣品濃度時，應考慮稀釋因子。

11. 如果清洗液在 4 ℃ 下儲存期間結(jié)晶，則在 37 ℃ 下加熱溶液并振搖直至結(jié)晶混懸。

試驗程序

標準品和樣品制備。標準品和樣品應同時加入孔中。在單獨的 96 孔板中制備標準品和樣品，并同時轉(zhuǎn)移至 ELISA 板中。不得在 ELISA 板中制備溶液。

檢測方法

• 留出 12 個孔，標記用于標準肽稀釋液。如下表 2 所示，一式兩份配置 6 個濃度的標準肽。切勿直接使用 ELISA 孔進行稀釋。各孔的終總體積應為 50 l。

表 2. 標準品稀釋液該稀釋系列用于 225 pg/mL 標準肽。

2. 空白、標準品和樣品制備：（在單獨的多孔培養(yǎng)皿中預混合溶液，并將溶液同時轉(zhuǎn)移至 ELISA 培養(yǎng)皿中。不得在 ELISA 皿中預混合溶液）。

a) 空白孔：設(shè)置兩個“空白孔”：“重現(xiàn)樣品溶劑（不含樣品）相對于空白溶液中樣品稀釋劑的比例。空白溶液重現(xiàn)了不含抗原的樣品溶液的含量。對于每個空白孔，制備 50 μL 混合的“空白溶液”。

b) 標準品溶液孔：在各稀釋度下制備 50 μL 標準品。

c) 樣品孔：對于每個孔，制備 50 μL 樣品（可能已經(jīng)預先稀釋以滿足測定范圍）。

d) 同時將空白、標準品和樣品分配到 ELISA 試紙條中。

e) 立即分配 50 μL HRP 結(jié)合物檢測抗體溶液（組分 4 表

1) 至各孔。然后用封閉膜覆蓋微孔板。

f) 在 37 ℃ 培養(yǎng)箱中輕輕混合 30 min。

3. 孵育期間，制備清洗液：用 dH20 將 30 倍清洗液稀釋至 1 倍。每孔制備 600 μL 1X 清洗液。

4. 清洗：小心移除密封件膜：請勿交叉污染液體。輕輕抽吸

去除每個孔中的液體。翻轉(zhuǎn)平板并在吸水紙上拍干。加入 100 μL 清洗液

溶液并在抽吸前在孔中滲濾 3 min。輕輕旋轉(zhuǎn)酶標板。重復清洗步驟 5 次，清洗 30 秒。因此，每孔總共需要 600 μL 清洗液。也可以使用自動清洗器清洗 ELISA 孔。吸干微孔板，但不允許微孔干燥。

5. 顯色：每孔先同時加顯色液 A 50 μL，再每孔同時加顯色液 B 50 μL。輕輕混合溶液 A 和 B。將平板在 37 ℃ 下避光孵育 10 min。

6. 終止：每孔加入 50 μL 終止液終止反應（藍色變?yōu)辄S色）。佩戴護目鏡：終止液含有酸。

• 在加終止液 10 min 內(nèi)，在 450 nm 處讀取樣品：設(shè)空白孔為零，測定各孔在 450 nm 處的吸光度 (OD)。

數(shù)據(jù)分析

1. 用空白標準溶液和相應的 OD 值繪制標準曲線。您可能希望計算線性回歸方程，以確定您樣本的濃度。請記住，在終計算中，樣品在試驗中稀釋了 5 倍。用于計算樣品濃度的其他數(shù)據(jù)分析方法也適用。

程序流程圖

制備標準品、空白和樣品

向孔中加入樣品和 HPR 檢測抗體結(jié)合物，在 37 ℃ 下室溫孵育 30 min。

每孔洗滌 6 次

加入顯色液 A 和 B，37 ℃，10 min，暗處 

加入終止液