neuroprobe Z02說(shuō)明書(shū)

神經(jīng)探針Z02

• 一般說(shuō)明
• 使用Z02的視覺(jué)檢測(cè)，由Sally Zigmond提供
• 故障排除
• 注意和警告

一般說(shuō)明

在對(duì)使用Z02腔室的過(guò)程進(jìn)行一般描述之后，將給出描述該腔室在特定類型的實(shí)驗(yàn)中的用途的特定協(xié)議。

通常，將一滴懸浮的細(xì)胞放在蓋玻片的中間。電池粘附后，將干玻璃的末端擦干，在6mm寬的濕部分留有粘附的電池。

將以此方式制備的蓋玻片倒置到帶凹槽的顯微鏡載玻片上，以使細(xì)胞覆蓋部分位于凹槽之間的橋上方。安裝夾具后，將細(xì)胞懸浮介質(zhì)和趨化因子吸移到兩個(gè)凹槽中，直到充滿并沒(méi)有氣泡為止。

然后孵育室。

經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)臅r(shí)間（取決于細(xì)胞類型和實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)）后，將玻片置于顯微鏡下，觀察并定量細(xì)胞的方向。遷移細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)也可以通過(guò)使用高功率光學(xué)顯微鏡來(lái)研究。

使用Z02的視覺(jué)檢測(cè)，由Sally Zigmond提供

1. 每次使用前都要清潔腔室。用組織培養(yǎng)清潔劑在溫水中洗滌，用蒸餾水沖洗干凈并擦干。也可以用70％或95％的ETOH擦拭橋接器。
2. 在22mm x 40mm蓋玻片的中心放置一滴血（例如，用手指刺）。必須在每個(gè)蓋玻片上放置足夠的血液，以使其凝結(jié)并部分縮回而不干燥。每個(gè)蓋板玻璃大約需要100 µL。
3. 將帶血的蓋玻片放在有或沒(méi)有CO 2的 37°C的潮濕室內(nèi)（例如，裝有濕濾紙的培養(yǎng)皿中）。
4. 大約45分鐘后，血液凝結(jié)并開(kāi)始收縮，并且在邊緣周圍可見(jiàn)液體。此時(shí)，可以用0.9％的鹽水輕輕沖洗掉血和紅細(xì)胞。單層細(xì)胞（主要是嗜中性粒細(xì)胞）保留在蓋玻片上。不要讓細(xì)胞干燥。
5. 通過(guò)將明膠溶解在沸騰的去離子水中制備10％的明膠原料。加熱原料使其熔化，并用已除去碳酸氫鹽的Hanks培養(yǎng)基以1:10的比例稀釋，并用pH 7.2的HEPES緩沖液（2.40 g HEPES /升）代替。用Hanks稀釋時(shí)，請(qǐng)確保明膠確實(shí)在溶液中。該介質(zhì)是弱酸性和低滲的。這些條件有助于良好的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。堿性pH和高滲具有抑制作用。
6. 用幾滴這種孵育培養(yǎng)基沖洗蓋玻片上的細(xì)胞層。快速排出蓋玻片上的液體，用Kimwipe擦干蓋玻片的端部，然后將蓋玻片倒置到培養(yǎng)箱中，使細(xì)胞位于橋上。
7. 將夾子放在玻璃顯微鏡蓋玻片組件的每一側(cè)。不要移動(dòng)防護(hù)玻璃 ; 任何移動(dòng)都會(huì)溶解橋上的細(xì)胞。腔室組件需要一些練習(xí)。在細(xì)胞上的液體少（但不允許細(xì)胞干燥）的情況下，蓋玻片和橋之間的距離將非常薄；5微米是宜選擇（細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)輕微擠壓）。如果該間隙太大，則細(xì)胞將不能很好地定向。可以使用顯微鏡的微調(diào)旋鈕上的千分尺，通過(guò)橋頂部和蓋玻片底部之間的焦平面差來(lái)測(cè)量間隙。通過(guò)練習(xí)，您可以從一側(cè)放下防護(hù)玻璃。這有助于消除橋上的氣泡；它們會(huì)干擾細(xì)胞方向。
8. 蓋好玻璃蓋后，用移液管吸取100 µL介質(zhì)到其中一個(gè)凹槽的開(kāi)口端。用移液管吸取100 µL趨化因子（或陰性對(duì)照室的細(xì)胞懸浮介質(zhì)）到另一個(gè)槽中。
9. 在37°C下孵育約20分鐘，以使細(xì)胞產(chǎn)生反應(yīng)。（對(duì)于其他細(xì)胞類型，可能需要更長(zhǎng)的孵育時(shí)間。）
10. 使用40X相的物鏡觀察橋上的單元并評(píng)估單元方向。方向可以通過(guò)細(xì)胞形態(tài)來(lái)評(píng)分。運(yùn)動(dòng)細(xì)胞的前部有寬闊的lamellipodium，而尾巴則較細(xì)，可以呈球形或拉入回縮纖維。如果腔室在室溫下冷卻一段時(shí)間，則細(xì)胞會(huì)聚攏并且更難以刻劃。當(dāng)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)良好時(shí)，方向容易得分。
11. 方向應(yīng)在橋的特定位置（趨化劑側(cè)，中間或介質(zhì)側(cè)）評(píng)分。取向水平可以在橋的整個(gè)寬度上變化很大，這取決于化學(xué)引誘劑的濃度。沿著橋掃描給定的腔室，直到至少刻劃了100個(gè)細(xì)胞。

故障排除

許多偽像可以更改在給定字段中看到的方向級(jí)別。

1. 與氣泡和細(xì)胞團(tuán)相鄰的細(xì)胞趨于特異。這些因素改變了化學(xué)梯度的影響。
2. 如果細(xì)胞不形成極化形態(tài)，則它們可能死在橋上，但在凹槽上還活著。這可能是由于橋臟造成的，或者制備物太薄以至于細(xì)胞實(shí)際上已經(jīng)被溶解了。
3. 如果細(xì)胞形成極化形態(tài)但沒(méi)有定向，請(qǐng)檢查橋和蓋玻片之間的間隙是否足夠薄。如果間隙合適，請(qǐng)嘗試使用其他濃度的化學(xué)引誘劑。

注意和警告

Zigmond玻璃滑動(dòng)腔非常脆弱，很容易折斷，因此在操作和使用時(shí)要格外小心。固定蓋玻片的夾具具有可插入顯微鏡載玻片孔中的銷釘。貼合性好，因此要取下它，可能需要在提起夾具時(shí)順時(shí)針旋轉(zhuǎn)旋鈕。切勿嘗試撬開(kāi)銷釘。

腔室配有一個(gè)小內(nèi)六角扳手。如果銷釘不太容易擰出，請(qǐng)將其翻轉(zhuǎn)過(guò)來(lái)，將扳手插入銷釘?shù)撞康牧强字?，然后將其旋轉(zhuǎn)。與拉動(dòng)銷釘相反，轉(zhuǎn)動(dòng)銷釘可大程度地減少碎玻璃的機(jī)會(huì)。