Bioenno Lifesciences 是Bioenno Tech，LLC的子公司  。 Bioenno Lifesciences成立于2010年，已在美國加利福尼亞州圣安娜建立了研究，工程和制造工廠。自2011年以來，我們一直在為醫(yī)學界提供用于神經科學研究的*的醫(yī)療套件，并且一直在積極開發(fā)新技術。我們?yōu)榻M織的客戶群提供服務，這些組織包括哈佛醫(yī)學院，約翰霍普金斯大學，FDA，NIH，倫敦國王學院（英國），科隆大學（德國）和INSERM（法國）。

Bioenno 003760說明書

sliceGolgi Kit (Cat#003760)

• $39800$398.00

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Bioenno  還提供  sliceGolgi  套件，以及其他  固定劑 套件。該  sliceGolgi 套件的設計上運行的片/段高爾基染色。可以在自由漂浮的部分（厚度為50到400微米）上進行浸漬和染色。附加的  固定  試劑盒使用Bioenno醛來處理其他樣品。這些試劑盒已經在大鼠和小鼠的腦部進行了廣泛的測試，包括：

• 使用組織斬波器快速準備新鮮收獲的切片，例如急性切片。
• 器官型切片培養(yǎng)，  例如 培養(yǎng)的海馬切片和培養(yǎng)的皮質切片。
• 注入人工腦脊液（ACSF）的切片 ，已完成電生理記錄和給藥。
• 通過灌注或浸沒從 用生物烯醛固定劑 （目錄號：003780）固定的腦中獲得的切片  。可以在室溫（室溫，15℃– 25℃）下在50?400微米范圍內對固定的大腦進行系統(tǒng)切片，并且可以對這些切片單獨進行高爾基染色，單獨進行免疫組織化學/免疫細胞化學（ICC）或對高爾基染色和ICC進行組合。
• 額外的  固定 試劑盒可處理更多樣品。Bioenno建議您購買sliceGolgi試劑盒和固定試劑盒。

所述  sliceGolgi套件 可以被施加到視網膜，脊髓，和培養(yǎng)的細胞以染色神經元過程。

所述sliceGolgi套件產生樹突和棘（參見圖）的兩個可靠和高質量的標記。在50至200微米厚的切片中，神經元的浸漬  速度非常快，在某些情況下僅為2-3天。通常，浸漬需要4-7天，具體取決于切片的年齡和厚度。該試劑盒可以在室溫下的黑暗區(qū)域保存長達12個月。  

高爾基染色和免疫組織化學/免疫細胞化學（ICC）的結合  

Bioenno Tech已成功將sliceGolgi試劑盒與ICC結合使用在同一大腦區(qū)域（參見圖4-9）。為了進行高爾基染色和ICC的組合，首先對固定部分進行高爾基染色，然后再進行ICC：

（1）組織處理：先用生理鹽水對動物進行心臟灌注，然后再用Bioenno Tech開發(fā)的  固定劑 （目錄號：003780）進行灌注。從顱骨上解剖大腦，并在4ºC下固定1-3天。然后在室溫下使用振動切片機或類似類型的切片機/切片機將腦切成50?100微米的厚度。將切片收集在0.1M PB（pH 7.4）中，并在4ºC下可以在緩沖液中保存長達一周。  

固定部分可單獨用于高爾基體染色，單獨用于ICC，以及用于高爾基體染色和ICC的組合。

（2）  高爾基染色：  在室溫下使用sliceGolgi試劑盒 對自由漂浮的切片進行高爾基染色  。神經元的浸漬可能需要2-5天。

（3）  ICC：  自由漂浮的切片可以接受標準的抗生物素蛋白-生物素復合物（ABC）方法。通過在含有H 2 O 2的 3,3'-二氨基聯苯胺（DAB）中孵育切片，可以看到免疫反應產物。

注： 該  sliceGolgi套件 不適用于冷凍組織工作。固定的組織塊在切割前無法冷凍。

產品特色

• 適用于切片/切片的組織（50至400微米厚）
• 在自由漂浮的部分上進行浸漬和染色
• 新型醛  固定劑 和增強浸漬溶液
• 神經元的浸漬很快（2-7天）
• 結合了高爾基染色和免疫組織化學
• 經過驗證的結果/用戶友好
• 足以容納多達  1,000個腦部切片 （50-400微米厚，尺寸約為1 x 1.5厘米）
• 供體外實驗室使用  
• 專門的技術支持
• 12個月保修

產品說明和協議

• sliceGolgi試劑盒協議
• 固定試劑盒方案

使用sliceGolgi試劑盒（目錄號003760）的可靠結果 

• 使用sliceGolgi試劑盒的可靠結果 

樹突狀分支和棘突已被sliceGolgi Kit可靠地浸漬和染色。  

圖1 –額葉皮層第II層中浸漬和染色的神經元

所述 sliceGolgi試劑盒 用于浸漬和染色神經元中一日齡12（P12）C57BL小鼠的額皮質。在200微米厚的切片中，神經元的樹突棘（箭頭）被正確標記。箭頭指示絲狀偽足狀突起，即未成熟的棘。使用20倍物鏡拍攝圖像。

圖2 –新皮質第三層中錐體神經元的樹突分支

所述sliceGolgi試劑盒用于浸漬和染色定位于額頂皮質的運動區(qū)在20x物鏡錐體神經元的樹突傾斜和主支路（干）。C57BL鼠標已經有12天了。  

圖3 –下丘腦外側的神經元

所述sliceGolgi試劑盒用于浸漬自由浮動的條件下在100微米厚的切片的神經元。從P12 C57BL小鼠的下丘腦外側區(qū)域取出帶有軸突末端的染色神經元（20倍物鏡）。在樹突分支上發(fā)現許多絲狀偽足樣突起（箭頭）。  

圖4  –  sliceGolgi Kit與免疫組織化學/免疫細胞化學（ICC）的組合使用

高爾基體染色和ICC的結合可以同時顯示樹突棘和免疫反應產物。通常，首先對自由浮動部分進行高爾基染色處理，然后再進行ICC處理。為了進行高爾基體染色，通過升主動脈向動物灌注0.9％的鹽溶液，然后是新鮮制備的固定劑（目錄號：003780，Bioenno Tech）。從顱骨上解剖大腦，后固定1-3天（4ºC）。然后，使用震動刀將大腦切成50-100μm的厚度，并將切片收集到0.1 M PB（pH 7.4）的組織培養(yǎng)孔中。該sliceGolgi套件      （目錄號：003760）用于浸漬（2-5天，RT）并對樹突（黑色）染色。為了進行ICC，對自由浮動的切片進行標準的抗生物素蛋白-生物素復合物（ABC）方法。通過將切片在含有0.01％H 2 O 2的 0.04％3,3'-二氨基聯苯胺（DAB）中孵育8-10分鐘，可以看到免疫反應產物。該圖像是使用4倍物鏡從2個月大的C57小鼠的海馬體上拍攝的。

圖5  –  在同一大腦切片上進行的高爾基染色和ICC

高爾基體染色和ICC結合：1）向C57小鼠心內灌注鹽水，然后用Bioenno開發(fā)的醛固定劑 （目錄號：003780）進行心臟灌注。2）使用sliceGolgi試劑盒對自由漂浮的切片（50微米）進行高爾基染色。浸漬時間僅在22±1ºC下為2天。3）使用標準抗生物素蛋白-生物素復合物方法處理小白蛋白（PV）的ICC。單克隆小鼠抗PV抗體（1：20,000，MAB1572，Chemicon）的孵育時間為22±1ºC過夜。圖像是使用4倍物鏡從丘腦拍攝的。   

圖6  –  樹突狀分支和PV免疫反應性神經元

高爾基體染色和ICC在同一大腦切片上進行。使用sliceGolgi Kit在自由漂浮的切片（100 µm）上進行高爾基染色。在22±1ºC下的浸漬時間為3天。圖像是從4個月大的C57小鼠的下眼部拍攝的（63倍物鏡）。 

圖7 –高爾基染色的樹突和免疫標記的神經元

所述sliceGolgi試劑盒用于浸漬和染色皮層神經元的樹枝狀分支在皮層的層III。免疫反應性神經元在同一區(qū)域可見。圖像是從4個月大的C57小鼠拍攝的（63倍物鏡）。  

圖8 –高爾基染色的皮質神經元和免疫標記的神經元

所述sliceGolgi試劑盒用于浸漬和染色神經元的樹枝狀分支在皮質的更深的層。在厚度為100 µm的切片中，神經元的浸漬僅在22±1ºC下進行了2天。免疫反應性神經元在同一區(qū)域可見。該圖像是使用20倍物鏡從2個月大的C57小鼠上拍攝的。  

圖9 –  在同一大腦切片上進行的高爾基染色和ICC

該sliceGolgi套件來標記樹突分支。頂部面板中以20倍物鏡顯示的方框區(qū)域被放大了（63倍），以突出顯示樹突棘（箭頭）和免疫標記的神經元（箭頭）。這些圖像是從2個月大的C57BL小鼠的額前額葉皮層（體感區(qū)）拍攝的。  

關于SliceGolgi套件的常見問題解答

·       我正在使用sliceGolgi套件。組織可以在固定劑中保存多長時間？

試劑盒或其他固定劑試劑盒（目錄號：003780）提供的固定劑會影響神經元的染色。長時間（幾天到幾周）暴露于固定劑將導致許多軸突被染色，這將阻礙樹突棘的標記。

如果給動物灌注固定劑，通常無需固定后。如果必須將組織后固定，則將后組織盡可能短地固定。

·        我正在使用sliceGolgi套件。我可以在Bioenno固定劑固定的組織塊上進行浸漬嗎？

是。可以在組織塊或自由漂浮的部分上進行浸漬。如果您打算在組織塊上而不是在切片上進行浸漬，請在dH2O中沖洗組織塊幾個小時（更換dH2O數次）以去除多余的固定劑，然后使用浸漬溶液。

·如何將sliceGolgi試劑盒應用于器官切片培養(yǎng)物中？

從二氧化碳培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)物，在室溫下用0.1 M PB沖洗膜（培養(yǎng)物位于膜上）數秒鐘（在冷緩沖液中沖洗會導致棘突縮回），并將膜浸入試劑盒提供了固定劑。通常，暴露于固定劑中2-4小時會適合?350 µm切片。長期固定（例如整夜或幾天）可能會增加神經元軸突的標記。

·       如何使用sliceGolgi試劑盒進行高爾基體染色和免疫組化（IHC或ICC）的結合？

固定的部分首先在自由流動的條件下進行高爾基染色，然后再進行ICC。為了使合并的反應成功，請盡可能短地固定組織，并在2到3天內完成神經元的浸漬，因為長期暴露于固定劑和/或浸漬溶液中會阻礙許多抗原的表位。除了進行良好的高爾基染色外，用于ICC的抗生物素蛋白HRP檢測系統(tǒng)也應該非常靈敏。Bioenno  DAB-Kit  和  DAB-Co Kit  在以下步驟下可以很好地工作：

1）用生理鹽水灌注動物，然后用Bioenno固定劑（試劑盒中提供500毫升；或從固定劑試劑盒，目錄003780中）灌注20?25分鐘。從顱骨上解剖大腦，然后將其儲存在0.1M PB（pH 7.4）中，然后在室溫（?22ºC）下進行振動刀切片（?50微米）。可以在0.1M PB（pH 7.4）中收集切片。 如果灌注不好，將組織后固定1?3小時。

2）在室溫下使用sliceGolgi試劑盒對自由浮動的切片進行高爾基染色。在2到3天內完成浸漬。將切片在0.01 M PBS-T中短暫洗滌，然后染色（2?4分鐘）和后染色（?1分鐘）。 如果需要5到7天的神經元浸漬，接下來的ICC將非常困難。

3）用PBS-T清洗切片數分鐘，然后用H2O2（將30 µl原來的30％H2O2倒入10 ml PBS-T中）20分鐘，然后用PBS-T清洗。

4）進行標準ICC：將切片在一抗體中孵育過夜，在PBS-T中洗滌10?15分鐘，然后用生物素偶聯的第二抗體和抗生物素蛋白-生物素復合物洗滌。免疫反應產物可通過在含有H2O2的DAB或DAB鈷（例如Bioenno DAB或DAB-Co Kit）中孵育切片來觀察。

如果使用生物素標記的一抗體，則可以忽略上述生物素偶聯的第二抗體。 

5）安裝，風干，照常清理部分。具有Permount®安裝介質的蓋玻片。

SliceGolgi套件引用的一些出版物 

• 跑步誘導的記憶增強與老C57BL / 6小鼠海馬區(qū)CA1細棘的保存有關 
  徐本科，孫安邦，何云，馮謙，劉連，*才，羅煥敏（2017），  衰老神經生物學，52，106-116
   
• 神經性限制性沉默因子
  Katelin P Patterson，Jeremy M Barry，Megan M Curran，Akanksha Singh-Taylor，Gary Brennan，Neggy Rismanchi，Matias Page，Yoav Noam，Gregory 的神經元限制性沉默因子的功能和結構效應介導了發(fā)育性高熱驚厥引起的持久性記憶障礙 L Holmes和Tallie Z Baram（2017），  神經科學雜志，3748-16
   

• 急性同時應激后多種應激激素的收斂協同作用介導了持久的記憶障礙
  。YuncaiChen，Jenny Molet，Julie C.Lauterborn，Brian H.Trieu，Jessica L.Bolton，Katelin P.Patterson，Christine M.Gall，Gary Lynchand Tallie Z.Baram（2016），   神經科學雜志。 36（44），11295-11307
   
• NRP1在小腦的軸突引導和亞細胞靶標識別中的雙重功能
  Ludovic Telley，Christelle Cadilhac，Jean-Michel Cioni，Alexandre Dayer，Andrea B.Huber，Fabrice Ango（2016），  Neuron， 91（6），1-16
   
• FOXP2由相對MEF2C控制皮質電路和聲音通訊突觸接線
  易傳陳，蕭穎郭烏爾里希Bornschein，高橋弘，師陳蕓，關明呂，郝宇陽，桂月陳婧-林瑞，李益新，周云嘉，成信中，錢成廷，沃爾夫岡·埃納德，沃夫·海弗，斯萬特·派博，安·米·格雷比爾和劉富欽（2016）。 自然神經科學， 19，1513–1522
   

• 靶向促腎上腺皮質激素釋放激素表達神經元的轉基因小鼠品系中記者表達模式的多樣性。 
  *才，珍妮·莫萊，本杰明·岡恩，凱里·雷斯勒，塔莉·巴拉姆（2015）。 內分泌學，  156（12），4769-4780。
   

• CB 1受體在中性多刺神經元上的遺傳拯救可防止興奮性紋狀體突觸的喪失，但不能預防HD小鼠的運動障礙。
  Naydenov，AV，Sepers，MD，Swinney，K.，Raymond，LA，Palmiter，RD，＆Stella，N.（2014年）。 疾病的神經生物學，  71，  140-150。
   

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